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电泳图片光密度分析原理与方法

 

无论是DNA电泳图片还是RNA电泳图片,或者是蛋白的凝胶电泳图片包括Western blot膜、或者是化学发光膜图片,在图像分析的角度来看,都是同样的一种条带光密度分析的问题。分析电泳条带有专门的一类图像分析软件。常见的是Bandscan,Quantity One,而由各个凝胶电泳成像系统厂商自己编制的软件就更多了。其中Labworks是UVP公司生产的凝胶电泳成像系统上配用的拍摄与分析软件,实际上就是传说中大名鼎鼎的gel-pro。这个软件可以看作是Image-pro plus应用在电泳条带分析上的专业版。实际上所有的电泳条带分析软件在分析原理与功能上都没什么差别。只是软件界面与操作程序上各有不同。所以,了解了条带的分析原理后也就能自己学会各种软件的使用了。

分析电泳条带也是从拍摄电泳照片开始的,用平时的数码相机拍摄的电泳条带一般不能用来进行定量的分析,而必须使用专门的拍摄设备,大家一般称它为“凝胶成像系统”。它集中了观察,拍摄与分析凝胶的所有功能。一个凝胶成像系统包括了三个部分,暗箱,相机与电脑上的控制分析程序。让我们从使用成像系统的操作方法中来了解如何正确地拍摄与分析凝胶吧。

一、暗箱

一个最简单的暗箱就是个不透光的箱子里面放了一个紫外灯箱,高级一点的暗箱则有好几组灯光照明。当然,在箱子上面会有一个安放相机的地方。紫外灯箱是观察与拍摄凝胶的必需照明设备。它是用来观察EB染色的凝胶条带的。里面的紫外灯光能提供256nm,302nm及365nm的紫外光。在观察EB的红色荧光条带时,一般用302nm。在观察与拍摄蛋白凝胶的时候,必须使用透射白光照明。有的暗箱里会有白板照明灯,平时向上掀起靠在后壁上,使用时拉下来。简单的暗箱则是用一块荧光板放在紫外灯箱上面,用紫外光照射荧光板,发出白色光。用白板的透射光照明来拍摄蛋白凝胶的道理有点像医院里用灯箱来观察X光片。只有在透射光下,才能正确地反映凝胶上条带的光密度分布。

暗箱上面也有白光照明与紫外光照明。这是用来拍摄普通样品的灯光。比如拍摄Western blot膜。实际上一个照明配置完整的暗箱绝不仅仅是用来拍摄凝胶的。它可以拍摄多种小的实验样品,如组织与器官等。

图片:透射光下拍摄的蛋白凝胶图片条带层次很丰富的。普通照明下是没这个效果的。

二、相机与镜头系统。

凝胶成像系统使用的是单色数码相机,这是分析凝胶光密度的要求。使用单色相机的优点在于其感光度高。这对于拍摄强度很弱的荧光凝胶或化学发光膜都是必需的。数码相机从普通到高级的都有。最基本的应该配置一台冷CCD数码相机。要拍摄化学发光膜的话,最好是配置致冷温度能达到低于环境20-30度的冷CCD相机。与使用胶片曝光相比,用冷CCD拍摄化学发光的WB膜不仅仅是方便,而且具有更好的图片效果。而且能准确地控制曝光。

左图是普通照明下的膜片,右图是化学发光图像。一般来说,图片能拍摄得比压片干净漂亮而且能控制曝光正确。注意到图片上有一个个细小的亮点吗?这叫热噪声点。CCD的致冷温度越低。这种热噪声点就越少。这张图片是低于环境温度10度的冷CCD相机拍摄的。如果是普通相机,画幅上的样品会被热噪声点给淹没的。拿自己的数码相机在黑暗处不用闪光灯照点啥就能体会到了。
在拍摄弱光样品时,要使用相机拍摄12位灰度甚至16位灰度的单色图片。这样能使得照片上暗光部分有充足的细节表现。这样才不辜负价格昂贵的冷CCD相机。这种照片文件会很大,而且只在专业的图片软件上才能显示,在电脑的普通程序上需要经过转换才能显示。但它对于分析电泳条带是非常有利的。
拍摄弱光样品时采用的是积分曝光方式,不停地拍摄,不停地显示,直到曝光满意为止。所以肯定能得到一张满意的照片。

镜头系统也是凝胶成像系统的一个重要部分。它与普通的照相机变焦镜头功能相同,不过是对焦距,变焦放大缩小,还可以调整光圈。但不一样的是,它是一个近摄镜头,放大倍数在0.1倍到4倍之间。正好填补了显微镜与日常用数码相机的放大倍数之间的空缺。所以有时候制作的大体切片,在显微镜上不能完整拍摄的时候,也可以放到这里拍摄。在拍摄荧光样品时,必须使用滤光片来过滤掉激发光。最常见的就是在拍摄EB染色的凝胶时必须使用红色滤光片。

左图:普通相机未加滤光片拍摄的凝胶照片。右图:用冷CCD拍摄的凝胶照片。

关于CCD相机的另一些指标:

拍摄凝胶的专业CCD相机要用单色的。不能用彩色的。

CCD相机的象素基本上都在一百万多一点。拍摄的照片像素就是1000 X 1000多一点。

好的CCD相机能拍摄12位深度甚至16位深度的灰度图片。这是拍摄弱光样品所必需的。

冷CCD拍摄弱光样品时感光度更高。像化学发光膜这种弱光,最好用低于环境温度20度的冷CCD拍摄。

拍摄凝胶照片有什么技巧?有。

第一个注意事项是要把样品图片拍摄得尽可能大。让样品充满整个画面。样品拍得越大,测量就越准确。

第二个注意事项是要调整好曝光,不要让条带过亮或过暗。曝光过度的条带在光密度分析时肯定是错误的。

第三个刚才已经说了,要保存图片为TIFF格式。不能保存为jpeg格式。在拍摄弱光样品时,还必须保存为12位或者16位灰度的图片,这样的照片能保存肉眼不能分辨的弱光。在分析图片时,能从line profile上能够发现肉眼看不见的条带峰。

图片:当凝胶为竖长条的时候,可以把它横过来拍摄,能拍得大一点。

三、电脑上的控制与分析程序

到现在才讲到凝胶分析软件了。几乎所有的凝胶分析软件都集成相机控件,可以在程序上直接控制相机。如果是高级点的暗箱,它的照明控制也能集成到软件上。这样拍摄与分析就直接在凝胶分析软件上完成了。凝胶分析软件最基本的分析功能就是分析电泳条带的位置(可以测量条带分子量)与条带的光密度(可以测量相对的条带质量),叫做“1D-gel分析”。各种不同的软件操作方法不同,但都是在以下面这个程序进行分析:

图片:分析软件上的CCD相机控件与镜头控件。

1.旋转图片rotate image。

大家也许没把这当回事。也许是一般拍摄的照片是正好不需要旋转的。对分析软件来说,电泳图片的方向是有要求的,就是加样孔必须在图片正上方,而且必须保持泳道与条带的方向横平竖直。如果不是,就必须旋转图片调正。

2.选择泳道位置lanes。

似乎就是用一个矩形框把一个个泳道给框起来。不必全选,测哪几个泳道就选哪几个。

3.选择条带位置 bands。

在泳道里再截出一个框把条带给框住。与泳道一样,只需框住需要测量的条带。在选择泳道与条带时,软件可以自动选择,但是一般情况下,这个功能没用。还是自己手工选择比较方便。软件大多会有一个line profile图来帮助选择条带范围,这个图上面的曲线表现的是泳道上的光密度分布,一个峰表现的就是一个条带,峰顶是条带位置,条带的范围就是这个峰的两个山脚。会有一对方括号形状来表示条带范围,要用鼠标拖动这对方括号到相应的山脚处。

4.设定扣背景方式 background correction。

这一点绝不能忽略,扣背景方式也有多种选择,选择joining valleys方式是比较好的。如果不扣背景,会导致大得离谱的误差。注意条带峰的基线下面,其背景值与条带本身的面积差不多大了。对这张照片来说,如果不扣背景,测量的光密度值会增加一倍左右。

5.设置marker

跑电泳时都要跑个marker的。这个marker实际上就是测量分子量的参照。软件可以利用这个参照来测量各条带的分子量。这个操作会罗索一点。需要作的是:

a.指marker泳道。一般会默认第一泳道是marker。但实际跑电泳的时候,把marker放到别的泳道上也许更好。原则是让各样品泳道尽量与marker泳道靠得近点。从这个角度来说,marker放在中间泳道比放在边上更好。

b.指marker的分子量序列,就是把marker各条带的分子量一个个输入到程序里。

c.把marker分子量数值与marker泳道上的条带一一对应起来。

6.看结果。

这也算是一个操作步骤?算。作好了上面的选择之后,结果就自动计算出来了。但是一个图片的测量数据太多了,以至于很多人看着结果表单不知所措,哪个数据才需要的呢?见过一款软件真的很BT,能显示好几页没用的测量数据。想找到需要的数据挺费事的。

第一个要看的就是各条带的数据在哪个位置。一般的结果表单会把每个泳道的数据排成一列显示,如果要看第三泳道的第二个条带的数据,就在表单的第三列第二行上找数据。

第二个要看的是分子量数据,在表单上会标注为molecular weight 或者M.W.。实际测到的分子量数值不会是完全相同的。一般只要相差不超过3%,就可以认为其属于相同分子量。

第三个要看的是条带的光密度值。这个最罗索。会有一大堆各种各样的数据来迷惑你,让你不知道哪个才是。其实只有一个数据是有用的:IOD。有的软件上用I-vol来表示。其他的统统不必管它。

光密度值是一个相对值,原则上,只有同一张电泳图片上的分子量相同的条带之间才能进行比较。但是分子量不同的条带之间也勉强可以作一个量的比较。测量到了各条带的分子量与光密度,剩下的就不是图像分析的事情了。自己把数据抄到excel里去作柱状图。或者作统计计算。

大家可能注意到我没提光密度校正。是的,不是没作,而是程序已经自动作了。在你选择条带的时候,程序会自动选择相应的光密度较正方式。所以我们就不需要操心这个了。需要注意的是,所有的电泳图片能分成两类,一类是黑色背景,亮条带。另一类是白色背景,暗条带。一般程序会自动识别这两种类型,自动作好光密度校正。不过有时候图片不典型,也会让程序糊涂起来。程序弄错的时候,会表现在line profile上,你会发现上面的峰颠倒过来了。这时候就得找相应的设置。一个是指定一下分析任务,在DNA与protein之间正确地选择一个。另一个是在条带选择窗口里找“bright background, dark band”及“dark background, bright band”,在这两者之间选择一个正确的。

这里使用的是gel-pro程序的界面以及UVP的凝胶成像系统。本讲座的重点并不在于具体如何操作软件,而是讲解为什么要作这的操作。关于这个软件的操作另有详细的操作演示。其他的设备及软件使用方法在原理上是一样的。操作方法就得自己去学了。

图片:选错了条带亮暗的类型后,line profile曲线上的峰倒过来了。
 
 

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